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岡山産ぶどうに含まれるポリフェノールの分析
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岡山理科大学紀要第46号Appl-7(2010)
岡山産ぶどうに含まれるポリフェノールの分析
益岡典芳・黒田耕平*・岡田武彦**・橋本麻希・石原浩二
岡山理科大学理学部臨床生命科学科
*岡山理科大学大学院理学研究科博士課程材質理学専攻
**岡山理科大学大学院理学研究科修士課程臨床生命科学専攻
(2010年9月27日受付、2010年11月9日受理)
1緒言
ぶどうにはポリフェノール(アントシアニン,フラボンなど)が多く含有されていることが知られている
(1,2).我々は,そのポリフェノールの中のアントシアニンに注目し,ピオーネ(岡山特産ぶどう)の皮部か
らジュース作製したジュースはポリフェノールを豊富に含み抗酸化活`性が高く,ヒトの飲用試験で健康に
好影響を与えることを報告してきた(3).ぶどうの種類に限らず,ぶどうの皮と実にはポリフェノールが豊富
であると推定され,日常的にブドウを食べることは健康に効果的であると思われる.しかし,ぶどうの種類(交
配種)は多く,ポリフェノールが,どのくらい(濃度)含まれているか?どのようなボリフェノールが含まれて
いるのか?皮部と実部に違いがあるのか?などについては充分明らかにされていない本研究では,岡山県
で栽培されているぶどうに含まれるボリフェノールと,その中に含まれているカテキン,レスベラトロール
を分析した(図1).カテキンは緑茶に含まれて抗菌作用,抗癌性,抗酸化作用など(4,5)で,レスベラトロー
ルはピーナッツ,イタドリの根に含まれて抗炎症作用,抗癌性,寿命延長など(6,7)で注目されている.
2材料と方法
2-1材料と試薬
巨峰(〃tisZaけusca"aβ×lrtisレゴ"i化raL,tetrapIoidLの交配種,黒ぶどう),ピオーネ[1/Itis
IahrUscaβai化J':巨峰とカノンホールマスカット(Ⅸレズ"i企raLi"".)の交配種,黒ぶどう],桃太郎ぶど
う[グザルカラ×ネオマスカット(〃tjsしe"I化ra)の交配種,白ぶどう],マスカットオブアレキサンドリ
ア(白ぶどう,以降マスカットと略す)は岡山市北区北方のマーケットから購入した.トランスーレスベラト
ロール(Zra"←resveratrol),トランスーピセイド(tra"s-piceid,tra"缶resveratrol-3-glucoside),没食子
酸(gallicacidmonohydrate)は和光純薬工業株式会社から,カテキン[(+)-catechinhydrateルェピカ
テキン[(-)-epicatechin]はシグマ社から,塩化シアニジン(cyanidinchloride)はフナコシ株式会社から購
入した.
2-2試料の調製
レスベラトロールは光で異性化するため,レスベラトロール測定用試料の調製は遮光して行った(6).巨峰,
ピオーネ,桃太郎ぶどう,マスカットの4種類のぶどうのそれぞれの皮と実を手で剥き試験管にとり,直ち
に皮および実は別々に5倍量の50%メタノールー水(抽出溶媒)を加え,ミキサーで速やかにホモジナイズ
した.室温で静置して24時間抽出を行った.抽出液は減圧濃縮した後50%メタノールー水に溶かして試料
とした.
2-3アントシアニン、フラボン、ボリフェノールの分析
アントシアニンの測定は,試料を波長528,mでHPLC分析を行った.塩化シアニジンを使って検量線を作
成し,アントシアニン総量は塩化シアニジン当量として求めた(1,2,8).
フラボノイドの測定はChukwumah等の報告している方法に従って行った.試料2.0mlに5%硝酸ナトリ
ウム0.15,1を添加し,10%塩化アルミニウム0.15mlを添加し,10分間静置した.水L2mlと1M水

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益岡典芳・黒田耕平・岡田武彦・橋本麻希・石原浩二
酸化ナトリウム1.0mlを添加した.510,mの吸光度を測定した.試料中のフラボノイドは,カテキン当量
として求めた(7).
ポリフェノールの測定はNasr等の方法に従って行った.試料0.2mlに,水4.0m1,フオーリン・チオカ
ルトフェノール(Folin&Ciocalteau,sphenol)試薬0.2mlを添加し8分間反応させた.7%炭酸ナト
リウム0.6mlを添加し,40℃で30分静置した.570,mの吸光度を測定した.試料中のポリフェノールは,
没食子酸当量として求めた(9).
2-4LC-MSによるカテキン,スチルベン化合物(レスベラトロール,ピセイド)の測定
抽出液を0.4511mメンブランフィルターでろ過し試料とした.LC-MSはJMS-T100CS(日本電子製)で試料
20ノulを分析した.LC部は逆相カラム(TSK-gelODS-lOOV,の2.0×75mm),カラム温度:40℃,流速
0.2ml/min,検出波長は306,mで,溶出は水一メタノール系で,40分間でメタノールを0%から100%にリ
ニアグラジエントで増加させ分析を行った.マススペクトルはエレクトロスプレー負イオン化モード(ESI-)
で,質量(、/】z)範囲は50.0~1000.0を記録した.[検出器電圧(2300V),ニードル電圧(2000V),オリフ
イス1電圧(-80V),リングレンズ電圧(-17V),オリフイス1温度(80℃),スペクトル記録間隔(0.4
s),待ち時間(0.03s)]データ収集間隔0.5,sでデータを集め,マスクロマトグラム(MC)分析を行った.
標準物質を同様に分析し、検量線を作成した.
OH
OH
m1C〔8.J篇Ⅱ
OH
Epicatechin
OH
HO
OH
Catechin
八M
八M
OH
OH
/-N
、’
JL
HO
lm"s-Resvemtrol
HO
。~b・㈱。~C’
HOHO
HOHO
図1ぶどうに含まれる生理活,性化合物
3.結果
3-lぶどうの皮及び実に含まれるアントシアニン,フラポノイド,ポリフェノールの分析
表1ぶどうの皮及び実に含まれるアントシアニン,フラボノイド,ポリフェノール総量
皮部の含有量(mg/g)
ぶどうの種類
ポリフェノール
フラボノイド
アントシアニン
66皿
uuL0
士十一十一十一
巨峰
ピオーネ
桃太郎ぶどう
マスカット
103
53.2
10.5
0.95
23493880
3200
+|士十一十一
14.60
6.44
3.77
0.32
9322
1700
0100
+’十’十一+’
7.78
3.72
0.09
0.07

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岡山産ぶどうに含まれるポリフエノールの分析
実の含有量(mg/g)
ぶどうの種類
フラボノイド
ポリフェノール
アントシアニン
巨峰
ピオーネ
桃太郎ぶどう
マスカット
0.189±0.037
0.200±0.063
0.099±0.021
0.063±0.024
0.552
0.528
0.327
0.218
0126
0872
1000
0000
十一十一十一十一
0.018±0.004
0.022±0.002
0.003±0.001
0.001±0.001
実と比べ皮部にポリフェノールが多く含まれていた.ポリフェノール量の中では,アントシアニン量より
フラボノイド量が多かった.また,ポリフェノール濃度と,フラボノイド,アントシアニン濃度には,そ
れぞれ正の相関がみられた.皮部での相関係数はγ=0.92とγ=0.96であった(図2A)
(A)(B)
鵬'''0薑
;50(鵬/g)
…10
lilll
フラボノイド濃度舵Ul
アントシアーーン濃度卿
鋤鳩加5くり0
20
フラボノイド》濃度噸
y堂9
↓虹DP3lDb8dD::西口:。
’(”血印四)「廃一m印Ⅲ叩》
一団」(垣、)(、M叩》》
50
2LJ印廻
い………●艀
伽200300400500600700
ポリフェノール濃魔(pg/g)
ルド量・アントシアニン量とポリフェノール量
置(四角■,□),ピオーネ(丸●’○),桃太
ラ0ロ
ポリフェノール濃度(mg/g)
図2ぶどう皮部(A),ぶどう実部(B)に含まれるフラポノイ
黒色記号はフラボノイド,白色記号はアントシアニン.巨峰
ぶどう(三角▲,△),マスカット(菱◆,◇).
3-2ぶどうの皮.実に含まれるカテキン,エピカテキンの分析
フラボノイドの1つであるカテキン,エピカテキンをHPLC-ESI/MSした.カテキンの保持時間13.8分で,
質量分析スペクトル(MS)は、/z289(M-H十,100%)であった.エピカテキンは16.4分に溶出され,MSは
、/z289(M-H十,100)であった.、/z289のマスクロマトグラムより各検量線を作成し,カテキン量とエピカ
テキン量を算出した.
表2ぶどうの皮.実に含まれるカテキン,エピカテキン含量
皮部の含有量(L1g/g)
実の含有量(''9/g)
ぶどうの種類
エピカテキン
エピカテキン
カテキン
カテキン
巨峰
ピオーネ
桃太郎ぶどう
マスカット
0.99
5.16
3.12
2.14
士0.11
士2.28
士2.27
士0.53
1.35±0.88
11.48士3.32
11.48±6.14
1.22±0.35
1.23
2.12
0.15
0.36
士0.46
士0.72
±0.03
±0.22
4.78士2.03
4.50±1.40
5.98±0.69
0.20±0.07
ぶどうの実と皮部を比較すると,巨峰を除いてポリフェノールと同様に皮部にカテキン類が多く含まれて
いた.
3-3ぶどうの皮.実に含まれるスチルベン化合物の分析
トランスーレスベラトロールとトランスーピセイドはそれぞれ306,mに吸収極大を持っている.HPLC分析
では306,mの吸光度で検出した.ぶどうに含まれる量が極めて低いことと,光による異`|生化で生じるシス
体を検出するため,LC-MSで高感度に分析を行った(6).トランスーレスベラトロールのマススペクトルは〃iz

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益岡典芳・黒田耕平・岡田武彦・橋本麻希・石原浩二
227(M-H十,100%),228(24),トランスーピセイドは〃iz389(M-H十,21%),228(17),227(100)にピークを示し
た.ノワz/iz227でマスクロマトグラムを行うと,トランスーレスベラトロールは226分、シスーレスベラトロー
ルは23.7分,トランスーピセイドは19.6分,シスーピセイドは21.8分それぞれ溶出された.ノワz/12227のピ
ーク強度で,検量線を描きトランスーレスベラトロールとトランスーピセイドを定量した.シスーレスベラトロ
ールとシスーピセイドはそれぞれのトランス体の検量線を使い定量した.
表3ぶどうの皮.実に含まれるレスベラトロールとピセイド含量
皮部の含有量(Iug/g)
シスーピセイド
トランスーピセイド
シスーレスへ゛ラトロール
トランスーレスへ゛ラトロール
0.910±0.149
<0.018
58.103±11.140
24.745±2.682
0.045±0.004
0.179±0.060
2.801±0.290
2.833±0.118
巨峰
ピオーネ
桃太郎ぶどう
マスカット
<0.107
<0.099
<0.269
2.535±0.110
<0.107
<0.099
<0.269
12.253±2.897
実の含有量皿g/g)
シスーピセイド
トランスーピセイト゛
シスーレスベラトロール
トランスーレスベラトロール
<0.003
<0.003
0.161±0.026
0.046±0.005
〈0.003
〈0.003
0.110±0.028
〈0.003
巨峰
ピオーネ
桃太郎ぶどう
マスカット
<0.019
<0.019
<0.019
<0.019
<0.019
<0.019
<0.019
<0.019
(<定量下限,S/N=3)
レスベラトロールとその配糖体(ピセイド)のトランスおよびシス異性体が検出された.スチルベン化合物
は黒ぶどうより白ぶどうに多く含まれ,実より皮部に多く含まれていた.
4.考察
ぶどうに含まれるポリフェノールが注目されている理由の1つに,フレンチパラドックス(French
Paradox)が挙げられる.フレンチパラドックは,フランス人が飽和脂肪酸を多量に含むバターや肉などの食
物を多食しているにも関わらず,赤ワインを多飲することにより,心臓血管病,高血圧,高脂血症などが少
ないことを言う.これは,ワイン中のポリフェノールの効果とされている.本研究でポリフェノールとその
構成成分であるアントシアニン,フラボノイドカテキン,スチルベン化合物を分析した(図1).
ポリフェノール,フラボノイド,アントシアニンの結果を(表l)に示す.皮部と実を比較すると,皮部には,
それらが実部に比べて約100倍近く高濃度であった.一方,色の濃い黒ぶどうではポリフェノール,アントシ
アニン,フラボノイドの濃度が高く,色の薄い白ぶどうでは全て低濃度であった.また,種を超えて,ポリ
フェノール濃度と,フラボノイド,アントシアニン濃度には,正の相関がみられた(図2).これは黒ぶどう
アントシアニン調節遺伝子の突然変異が起ったことで白ぶどうができた(10)と推定されているので,その
遺伝子調節はアントシアニンの生合成の上流にあるフラボノイドの生合成経路より更に上流で起こっている
と考えられた(図3).
フラボノイドに含まれる化合物カテキン類については,黒ぶどうの巨峰では皮部と実のカテキン濃度が逆
転していた.実と皮部の重量比が約9であることを考慮すると,巨峰にも多く含まれると推定された(表2).
また,ぶどうの種類によりエピカテキンとカテキンの害||合も皮部では057-3.68,実では056-39.9と大
きく変動していた.このことはフラボノイドの各成分では,種の違いにより成分濃度および果実での分布が
異なる可能性があることが示された.
続いて,ポリフェノールの1つであるスチルベン化合物については,ポリフェノール総量から予想される
結果と逆になり,白ぶどうの皮部に多く含まれていた.また,このレスベラトロールとピセイドはイタドリ
の根ではシス異性体が僅か検出されただけである(6)が,ぶどうでは遮光条件で分析したにもかかわらず高濃
度のシス異性体が検出された.更に,レスベラトロールのトランス体/シス体の比とピセイドの比を較べると,

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岡山産ぶどうに含まれるポリフエノールの分析
例外もあるが,シス異性体が多く検出された.これは,invitroの光による異」性化反応ではレスベラトロー
ルよりピセイド(配糖体)の方が速やかに起こることから,果実に蓄積されたレスベラトロール,ピセイドが
光によりシス体に異性化したと説明できる.また,白ぶどうにレスベラトロールが多く含まれることから,
ぶどうアントシアニン生合成調節遺伝子はジスチルベンの生合成経路への枝分かれより下流で,生合成の
調節を行っていると推定できた(図3).
以上の結果から,ぶどうの種類によりポリフェノール,アントシアニン,フラボノイド,スチルベン化合
物の含有量に大きな違いがあることが明確になった.色の濃いぶどうはポリフェノール含有量が高いこと,
色の薄いぶどうはポリフェノール含有量が低いがポリフェノールの1種であるスチルベン化合物を多く含む
ことが明確になった.ポリフェノールは栽培時の温度変化および乾燥度(乾燥ストレス)により影響されるこ
とも報告されている(11,12)こと,レスベラトロールは植物では防御化合物として働き動物に強い作用を持
つと推定されることから更に詳細な分析が必要と考えている.
Phenylalanine-->Tyrosine
l
Stilbenes
(trans-Resveratrol)
4-CoumalylCoA->
、(
厨両
Leukoanthocyanidin
ムダ
PI5iI祠
Catechins
Tetrahydroxychalcone
X
Flavanones-Flavones
、I
Anthocyanins
Flavonols
Flavanols-
図3ポリフェノールの生合成経路
5.謝辞
本研究の-部は文部科学省学術高度化推進事業「社会連携研究推進事業」岡山理科大学「地域社会とのコ
ラボレーションによるQOL向上の一体的アプローチ」研究の一環として行った.
6.文献
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ィブおかやま」セミナー抄録2004,pp、5-6.
2)H、Kawanishi,H・Hamada,N・Masuoka,Activationfactorsofantioxidantenzymeactivityinapurplesweetpotato
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3)N・Masuoka,,.H、Wan9,M.Kogashiwa,KMiyashita,T・Nakaie,K・Ishihara,H・Hamada,Theeffbctofjuicemade
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益岡典芳・黒田耕平・岡田武彦・橋本麻希・石原浩二
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岡山産ぶどうに含まれるポリフェノールの分析
Analysiso缶severalpolyphenolcompoundsingrapes
culturedinOkayamaPrefbcture
NoriyoshiMASUOKA,KouheiKURODA*,TakehikoOKADA*,
MakiHASHIMOTOandKolljilSHIHARA
DeparZmentofLi允SbjDnCe,肋CuIがorSbjDnce,
*Gz1adHaZeSbhooIofSUience,
OAaJ'zmzaZノhjvBz3siztyorSbZence,
I-ZRitノai-cZlqZitmhJ,OAayazzza,〃0.〃”jZWn
(ReceivedSeptember27,2010;acceptedNovember9,2010)
Polyphenolsingrapesconsistedofflavonoids,anthocyanins,stilbenesandsoon.We
examinedcontentsofpolyphenolsinseveralkindsofgrapesculturedinOkayamaPrefecture・
Whencontentsofanthocyanins,flavonoidsandpolyphenolsinfruitofgrapeswerecompared
withthoseinskinofgrapes,allcontentsinskinofgrapesaregenerallyhigherthanthesein
fruit、Theirpolyphenolcontentsinred(Colored)grapesarehigherthanthesemwhite
(colorless)grapes・Furthermore,therearepositivecorrelationsbetweenpolyphenolcontents
andanthocyanincontentsorflavonoidcontents・UsingLC-MS,catechinandstilbenecontents
inthesegrapeswereexamined・Interestingly)trans-andcZSisomersofresveratrolandpiceid
aredetectedandarerichinskinofwhitegrapes.
Keywords:polyphenols;catechins;resveratrol;grapes.